劃重點：
1.iPSC培養(yǎng)過程中不建議使用抗生素，抗生素會影響細胞的活性和分化潛能。
2.iPSC培養(yǎng)環(huán)境應與其它細胞隔離，兩次傳代后檢測支原體。
01基質(zhì)膠用于多孔板的包被：
（1）將Gelnest?基質(zhì)膠(干細胞專用)置于冰中并在4℃融化，使用預冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
注：GelNest?基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多種多種生長因子。這些成分可以提供細胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號，模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，從而進一步模擬生理環(huán)境中的細胞信號通路和互動，提高細胞培養(yǎng)的成功率和效果。
（2）在冰上，將基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)液按照1:80或1:100的比例混勻，例如取1mL基質(zhì)膠加入80mL或100mL DMEM培養(yǎng)液中，使用預冷的移液管混合至均勻狀態(tài)。
注：可根據(jù)實驗具體情況調(diào)整稀釋比例。
（3）將6孔板置于冰上，按照每孔1mL向6孔板中加入稀釋后的基質(zhì)膠。
（4）將6孔板置于37℃孵育過夜。
注：一般情況下，孵育1小時即可使用，但過夜孵育的細胞培養(yǎng)效果更好。
（5）使用前吸出未結合的基質(zhì)膠。
注：需確保移液管的尖端不會刮傷涂層表面。
02 Y-27632 （ROCK抑制劑）溶液的配制
將Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注：Y-27632的工作濃度為10μM。
03配制含Y-27632的人胚胎干細胞培養(yǎng)液（如mTeSR?1或TeSR?-E8?）
取Y-27632溶液與mTeSR?1培養(yǎng)液按照1:1000的比例混勻，例如取10μl Y-27632溶液加入10mL mTeSR?1培養(yǎng)液中，即得10mL含10μM Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
04 iPSC復蘇：
（1）將凍存的iPSC置于37℃水浴迅速解凍，將細胞溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液沖洗凍存管兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中細胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（2）棄上清，用2mL含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液重懸iPSC，隨后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板的1個孔中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注：建議將每支復蘇的細胞(約100萬個)轉(zhuǎn)移至6孔板的1個孔中培養(yǎng)使細胞存活率最大化。
（3）第二天對iPSC進行換液，將含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液更換為不含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
注：可使用耐思新推出細胞復蘇儀替代原始細胞復蘇過程，細胞復蘇時間短，細胞存活率高。
05 iPSC傳代：
注：iPSC細胞生長至單層后會迅速分化并死亡，為保持其活性和多能性，需在長滿前進行傳代。
（1）去上清，用1mL PBS洗滌1次，加入1mL適當?shù)募毎?/p>
（2）將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育3分鐘。顯微鏡下觀察，大部分細胞脫落，若細胞仍附著，可以用手輕輕拍打培養(yǎng)板底部使細胞脫落。
（3）將消化下來的細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)板表面兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中的細胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（4）棄上清，用含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液進行重懸，隨后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
06iPSC凍存：
NEST生物樣本庫系列含有全規(guī)格細胞凍存管及凍存液，操作簡單，安全無菌。
（2）參考細胞凍存液的相關步驟進行細胞消化。
（3）計數(shù)，棄上清，加入適量凍存液，以每管1mL凍存液（約100萬個細胞）分裝至凍存管中。
（4）將細胞凍存管放置于可逐步降低溫度的NEST程序降溫盒內(nèi)并放置在-80℃冰箱內(nèi)，確保冷卻速度約為1℃/分鐘。通常冷卻速度不宜快于0.5℃/分鐘。
（5）放置在-80℃冰箱內(nèi)約24小時后轉(zhuǎn)移至液氮氣相中保存。
iPS細胞的成功誘導給細胞治療及再生醫(yī)學研究開辟了全新的道路。相信在不久的將來，iPSC技術能快速突破瓶頸，NEST也將持續(xù)研發(fā)新品，推動再生醫(yī)學的蓬勃發(fā)展，為患者帶來新生的希望！
